PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Dias F.E.F., Nunes C.M., Cavalcante T.V., Santos H.D. Minharro S. & Garcia J.F. 2012. [Fluorescent Multiplex PCR for detection of bacteria in semen bovine.] PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(3):211-216. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins, BR 153 Km 132, Zona Rural, Araguaína, TO 77804-970, Brazil. E-mail: eldadias@uft.edu.br This study aimed to evaluate the threshold of detection of fluorescent multiplex PCR coupled with capillary electrophoresis for detection of infectious agents in semen samples from experimentally infected with decreasing concentrations of the bacteria Brucella abortus, Leptospira interrogans serovar pomona, Campylobacter fetus and Haemophilus somnus. Samples of bovine semen were experimentally infected with decreasing concentrations of bacteria obtained from serial dilutions in the base 10 so as to obtain samples containing a long time until 10-7 bacteria/mL from the initial concentration of Lepstospira pomona, Brucella abortus, Haemophilus somnus and Campylobacter fetus. The dilutions were made individually for each bacterium, as well as in different concentrations needed to standardize the multiplex PCR test. DNA extractions of all solutions containing sperm and bacteria analyzed in this study were performed according to protocol described by Heinemann et al. (2000). The multiplex PCR products were analyzed by electrophoresis on 8% polyacrylamide gel and capillary electrophoretic separation system for automated equipment in the analysis of DNA fragments MegaBACE. We observed amplification of fragments of 193pb, 330pb, 415pb and 400bp from the DNA of B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus respectively. The analysis by capillary electrophoresis of multiplex PCR products of DNA for simultaneous detection of the four pathogens was observed by detecting the dilution of 10-3 bacteria / mL times the initial concentration of the stock solution of each bacterium. The multiplex PCR coupled with capillary electrophoresis was first used for the direct diagnosis of four pathogenic bacteria in semen, proving to be a rapid method to detect bacteria that cause reproductive disorders.

• Semen sêmen

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Dias F.E.F., Nunes C.M., Cavalcante T.V., Santos H.D. Minharro S. & Garcia J.F. 2012. [Fluorescent Multiplex PCR for detection of bacteria in semen bovine.] PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(3):211-216. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins, BR 153 Km 132, Zona Rural, Araguaína, TO 77804-970, Brazil. E-mail: eldadias@uft.edu.br Este estudo teve como objetivo avaliar o limiar de detecção da técnica de PCR multiplex fluorescente aliada a eletroforese capilar na detecção de agentes infecciosos em amostras de sêmen experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes das bactérias Brucella abortus, Leptospira interrogans sorovar pomona, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. Amostras de sêmen bovino foram experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes de bactérias obtidas através de diluições seriadas na base 10 de modo a obter-se amostras contendo desde 1 vez até 10-7 bactérias/mL a partir da concentração inicial de Leptospira pomona, Brucella abortus, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. As diluições foram efetuadas individualmente para cada bactéria, bem como nas diferentes concentrações necessárias para a padronização do teste de multiplex PCR. As extrações de DNA de todas as soluções contendo espermatozóides e bactérias analisadas no presente estudo foram realizadas segundo protocolo descrito por Heinemann et al. (2000). Os produtos de PCR multiplex foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e separação eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA MegaBace. Observou-se a amplificação de fragmentos de 193pb, 330pb, 400pb e 415pb a partir do DNA de B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus, respectivamente. Na análise por eletroforese capilar de produtos da PCR multiplex do DNA para detecção simultânea dos quatro patógenos observou-se a sinal de positividade até a diluição de 10-3 bactérias/mL vezes da concentração inicial da solução estoque de cada bactéria. A técnica de PCR multiplex aliada à eletroforese capilar foi usada pela primeira vez para o diagnóstico direto de quatro bactérias patogênicas no sêmen, demonstrando ser um método rápido na detecção de bactérias causadoras de doenças reprodutivas.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Rodrigues R.O., Silva J.A., Alves T.M., Dorneles E.M.S., Minharro S., Lage A.P., Leite R.C. & Moreira E.C. 2011. [Characterization of outer membrane proteins of serovar Hardjo isolated from cattle in Minas Gerais, Brazil.] Caracterização das proteínas de superfície de membrana externa da sorovariedade Hardjo isolada de bovinos em Minas Gerais. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(7):555-560. Universidade Vale do Rio Doce, Campus Antônio Rodrigues Coelho, Rua Israel Pinheiro 2000, Bairro Universitário, Cx. Postal 295, Governador Valadares, MG 35020-220, Brazil. E-mail: rogerrodriguesvet@gmail.com Differences in the protein profile of Leptospira sp. strains Sponselee, Norma and Hardjoprajitno were observed, with bands ranging from 175.47 kDa to 12.10 kDa. Strain Sponselee presented a 12-band profile, while strain Norma showed 11 and strain Hardjoprajitno showed 9 bands in the profile. All bands observed in Sponselee strain profile could match bands in the other two strains. Strain Norma lacks a band at 35.77 kDa and strain Hardjoprajitno lacks the bands at 89.59 kDa, 35.77 kDa and 12.10 kDa. The recognition profile from hyperimmune sera was also different for the studied serovar Hadjo strains. The majority of recognized proteins was in the range of 35.83 kDa to 29.19 kDa. Cattle sera against strain Norma only recognized low molecular mass proteins in strains Norma (6.80 kDa) and Hardjoprajitno (6.80 kDa and 5.30 kDa). Bovine sera against strain Hardjoprajitno recognized a 44.33 kDa protein in all studied strains and proteins of 4.22 kDa in strains Sponselee and Norma and of 10.49 kDa and 6.16 kDa in strain Hadjoprajitno. The different identified proteins could become specific targets to the development of diagnostic tests and vaccines against bovine leptospirosis.

• Leptospira serovar Hardjo protein profile Leptospira sorovar Hardjo perfil protéico

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Rodrigues R.O., Silva J.A., Alves T.M., Dorneles E.M.S., Minharro S., Lage A.P., Leite R.C. & Moreira E.C. 2011. [Characterization of outer membrane proteins of serovar Hardjo isolated from cattle in Minas Gerais, Brazil.] Caracterização das proteínas de superfície de membrana externa da sorovariedade Hardjo isolada de bovinos em Minas Gerais. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(7):555-560. Universidade Vale do Rio Doce, Campus Antônio Rodrigues Coelho, Rua Israel Pinheiro 2000, Bairro Universitário, Cx. Postal 295, Governador Valadares, MG 35020-220, Brazil. E-mail: rogerrodriguesvet@gmail.com Foram identificadas diferenças no perfil protéico das amostras de Sponselee, Norma e Hardjoprajitno, com bandas protéicas entre 175, 47 kDA e 12,10 kDa. A amostra Sponselee foi a que apresentou maior número de bandas (12), seguida da Norma que apresentou 11 bandas e de Hardjoprajitno que apresentou 9 bandas. Todas as bandas observadas na amostra Sponselee possuíam correspondentes nas outras duas amostras. A amostra Norma não apresentou uma banda em torno de 35,77 kDa e a Hardjoprajitno não apresentou bandas em torno de 89,59 kDa, 35,77 kDa e 12,10 kDa. O reconhecimento dessas proteínas por soros hiperimunes contra cada uma das amostras também mostrou diferenças, sendo que o maior número de proteínas reconhecido em todas as amostras por todos os soros se encontrou entre 35,83 kDa e 29,19 kDa. Os soros contra bovino na amostra Norma só reconheceu proteínas de baixa massa molecular nas amostras Norma (6,80 kDa) e Hardjoprajitno (6,80 kDa e 5,30 kDa). Soro bovino contra a amostra Hardjoprajitno reconheceu uma proteína de 44,33 kDa todas às amostras e proteínas de 4,22 kDa nas amostras Sponselee e Norma e de 10,49 kDa e 6,16 kDa na Hardjoprajitno. As diferentes proteínas identificadas poderiam se constituir em alvos específicos para o desenvolvimento de testes diagnósticos e vacinas contra leptospirose bovina.